ibidiµ-Slide2Well共培養(yǎng)實驗方案，實驗描述了將斑馬魚幼蟲嵌入低百分比低熔點瓊脂糖進行延時顯微鏡觀察的過程。

　　2.共培養(yǎng)實驗設(shè)備　　

　　(ibidi, 81806)

　　• 熱混合器 (例如，Eppendorf，ThermoMixer C)

　　• µ-Slide 2孔共培養(yǎng)載玻片，ibiTreat底部處理 (ibidi, 81806)

　　• 塑料移液管

　　• 可選： 小刷子

　　• 顯微鏡

　　3.實驗步驟

　　實驗準備工作：

　　在開始實驗之前，按照“緩沖液和溶液"部分的描述準備LMPA。保持在35°C，直到需要使用。如果瓊脂已經(jīng)提前準備好，可以在熱混合器中重新加熱 (~80°C)，然后讓瓊脂冷卻 (~35°C)。

　　裝載：　

　　在我們小組的某些實驗中，對斑馬魚脊髓進行了機械性損傷。如果這樣做，建議請在裝載前讓幼魚恢復(fù)至少30分鐘。在脊髓橫切后，嵌入瓊脂的初始存活率為80%。這些幼魚在瓊脂中觀察48小時后也都存活了。未受傷的幼魚的初始存活率接近100%。

　　1. 使用三氯-甲-烷使用溶液麻醉斑馬魚幼魚2分鐘。

　　2. 使用塑料移液管在µ-Slide 2孔共培養(yǎng)載玻片的每個孔中放置一只幼魚，并使用一些多余的魚水。

　　3. 對每只幼魚單獨執(zhí)行以下步驟（以避免變干）：

　　3.1. 使用塑料移液管除去所有魚水。

　　3.2. 向小孔中加入50µl LMPA，以覆蓋幼魚。

　　3.3. 使用刷子或小的移液管頭將幼魚定位到適當?shù)奈恢茫▊?cè)面位置，盡可能水平和直立，具有統(tǒng)一的對準，即始終向左，卵黃在底部）。

　　4. 讓LMPA凝膠固化（0.5%凝膠約需20-30分鐘）。

　　5. 可選：用包含80mg / L三氯-甲-烷庫存溶液的1x魚水覆蓋固化的LMPA凝膠，以進行連續(xù)成像的麻醉。

　　6. 用自帶的蓋子蓋住µ-Slide 2孔共培養(yǎng)載玻片，以避免蒸發(fā)。

　　7. 斑馬魚幼魚已經(jīng)上樣好準備成像

　　在48小時的成像期間，如果蓋子緊閉，則無需在瓊脂上方加入魚水，因為標本不會變干。這也使得可以進行正置顯微鏡觀察，而不必擔心灑出來。　　

圖1：斑馬魚幼蟲嵌入LMPA中的µ-Slide 2孔共培養(yǎng)器

　　延時顯微鏡觀察：

　　這種樣品制備方法被用于連續(xù)延時顯微鏡，以及使用德累斯頓技術(shù)大學CRTD的核心設(shè)施——光學顯微鏡設(shè)施的各種顯微鏡在不同時間點拍攝某些視場的快照。 這包括倒置和正置，廣角和共聚焦顯微鏡。　　

圖2：A）斑馬魚幼蟲受精后72小時，埋入瓊脂3小時后的整個µ-Slide 2孔共培養(yǎng)器的亮場瓦片掃描，共有18條幼魚